In Druckgasen Keime sammeln - für medizinisch-pharmazeutische Anwendungen - Welche Methode ist optimal?

Übliches Reduzierventil

Drosselspalt im Ventil geschlossen

Drosselspalt im Ventil etwas geöffnet

Patent:

In der einschlägigen Literatur findet man diverse Methoden zur Sammlung von vegetativen Keimen in Gasen. Mit den dafür entwickelten Geräten kann eine Bestimmung und Auswertung der Keimzahlen erfolgen.

Gerade aktuell, in Corona-Zeiten, ist der Nachweis von bakteriellen Keimen durch deren Eigenschaft, auch Trägersubstanz für Viren zu sein, wichtiger denn je.

Über die in den diversen Sammelgeräten angewandten physikalischen Prinzipien wird hier ein kurzer Überblick gegeben und mit einer Bewertung versehen. Die wichtigsten Kriterien (ohne Vollständigkeitsanspruch) werden aufgezeigt. Das empfohlene Gerät wird anhand der wichtigsten Eigenschaften vorgestellt.

Sedimentation (Absetzverfahren)

Die Teilchen werden entweder durch Schwerkraft (passive Sammlung) oder durch Fliehkräfte (zur Konzentration des Sammelvolumens, z.B. bei Aerosolen - aktive Sammlung) auf Nährböden in Petrischalen aufgeimpft oder in einer Flüssigkeit gesammelt.

Durch die unterschiedlichen Teilchengrößen ist die Sammlung nicht repräsentativ, da die Masse der Teilchen, der Zeitfaktor für die Sedimentation oder die Haftung auf der Nährlösung dabei eine wichtige Rolle spielt. Bei diesen Faktoren/Parametern handelt es sich um schwierig erfassbare Einflussgrößen.

Bewertung: ungeeignet für Druckgase.

Impaktion (Aufprall auf feste Nährböden)

Eine starke Beschleunigung der Partikel / Keime durch Umlenkung, auch über Kaskadenschaltung oder über Düsen, erzeugt die zum Aufbringen auf feste Oberflächen erforderliche Kraft.

Durch die Massenträgheit wird erreicht, dass die Teilchengröße leicht fraktioniert (Kaskadenschaltung) werden kann und auch besser auf Oberflächen haftet.

Bewertung: teilweise geeignet, falls vor dem Aufbringen der Partikel / Keime eine Einrichtung zur Druckreduktion vorhanden ist (mit Einschränkung, siehe „Worauf kommt es an“ – letztes Kapitel).

Zentrifugation (Fliehkraftverfahren)

Die Partikel und somit auch Keime werden im Gas in Rotation versetzt und durch die erzeugte Massenfliehkraft bei hoher Bahngeschwindigkeit in Abhängigkeit vom Bahnradius stark beschleunigt. So können diese anschließend auf Prallflächen, die mit Nährlösung beschichtet sind, aufgefangen werden.

Bei der Anwendung für Gase darf in der Regel keine Flüssigkeit in den Gasstrom injiziert werden (um z.B. eine Anreicherung an den Flüssigkeitströpfchen zu erreichen). Andernfalls ist die Flüssigkeit mit dem System zusammen zu validieren.

Standardmäßig werden die Gase über eine Düse auf Petrischalen aufgeblasen.

Bewertung: teilweise geeignet, falls vor dem Aufbringen der Partikel / Keime eine Einrichtung zur Druckreduktion vorhanden ist (mit Einschränkung, siehe „Worauf kommt es an“ – letztes Kapitel).

Impingement (Gaswaschverfahren)

Hier handelt es sich um eine spezielle Art der Sammlung nach dem Prinzip der Massenträgheit (siehe Impaktion).

Das Gas (Aerosol) wird mit Unterdruck über ein Kapillarrohr angesaugt und über eine Düse in ein flüssiges Sammelmedium geführt. Es können dabei Geschwindigkeiten bis zur Höhe der Schallgeschwindigkeit erreicht werden. Dies kann sowohl Zellen verletzen als auch – durch Separation - im Medium zu unerwünschtem Wachstum führen. In der Regel ist das Medium eine vorher sterilisierte Nährlösung. Dabei kann es auch zu unerwünschten Zellverklebungen kommen. Im Anschluss wird das beladene Medium über ein aseptisches Filter filtriert.

Dieses Filter wird dann auf eine sterile Petrischale gelegt, mit geeignetem Nährmedium aufgefüllt und anschließend bebrütet und ausgezählt.

Bewertung: ungeeignet für Druckgase.

Filtration

Hierbei wird das Gas in oder über ein suspendiertes oder membranartiges Filtermaterial geleitet. Der Mechanismus beruht wiederum auf dem Prinzip der Massenträgheit mit ihrer Abscheidewirkung oder/und einer Diffusion oder/und  elektrostatischer Anziehung.

Bei der Filtration über Membranfilter werden sowohl vorher sterilisierte Filterscheiben (0.2 µm Porengröße) oder wasserlösliche Gelatinefilter (0.45 µm Porengröße) verwendet.

Bei ersterem erfolgt die Auswertung durch anschließendes Auflegen auf Petrischalen mit Agar und Bebrütung; danach folgt die KBE-Bestimmung (KBE=Kolonien bildende Einheiten).

Bei der Filterung über wasserlösliche Gelatine wird diese in einem flüssigen Medium aufgelöst und die Keime daraus bestimmt (z.B. Influenzaviren).

Bewertung: geeignet für Druckgase.

Worauf kommt es an?

Auf dem Markt der Anbieter ist lediglich ein Keimsammler zu finden, welcher speziell nur für Druckgase entwickelt wurde.

Dies ist der SCHICO-Keimsammler M2000, gebaut nach den Regeln der DIN EN ISO 14698.

Das System ist validiert (Artikel, erschienen in: Pharm. Ind. 70, Nr. 2, 250–300 (2008)). Für die Vorrichtung wurde ein deutsches Patent erteilt, siehe Urkunde.

Zusammenfassend gibt es für die Auswahl der Methoden folgende, hier vorgeschlagene, Kriterien:

- Vollständige und ausschließliche Erfassung des zu prüfenden Gasvolumens (kein Nebeneintrag eines anderen Gases, insbesondere von Umgebungsluft).
- Einfache und exakte Bestimmung / Einstellung des Messvolumens mit hoher Genauigkeit, automatisch geregelt (falls Druckschwankungen im Netz vorliegen), einzustellender Bereich für Gasmenge/Volumen: 1-16 m³.
- Kurzer Zeitaufwand zur Durchführung einer Messung, z.B. für 1 m³ etwa 15 min.
- Großer, variabel einstellbarer Druckbereich für das zu prüfende Gas, z.B. 0.5 – 8 bar Überdruck, ohne Reduktionsorgane (Drosselorgane), um das Gas mit dem Druck zu prüfen/sammeln, bei dem es in der Produktion später verwendet wird.

Dadurch wird vermieden, dass bereits vor der Auswertung vegetative Keime abgetötet und somit nicht über die übliche Auswertemethode erfasst werden.

Zur Erläuterung drei Bilder vom Drosselorgan, wie dieses z.B. in einer üblichen Druckreduziervorrichtung zu finden ist. Im Drosselspalt werden Scherspannungen wirksam, die zu einer Desaktivierung von vegetativen Keimen führen. Die Zellmembran wird aufgebrochen, insbesondere dann, wenn sich die Zelle dabei im Teilungszustand befindet.

Auch in Düsen findet eine Druckreduktion statt, die ähnlich der in Drosselorganen ist; sie besitzt ebenfalls zerstörende Wirkung. Da am Austritt der Düse schlagartige Druckentspannung stattfindet, kann dies auch zur Zellzerstörung beitragen.

Methoden nach dem Impaktions- und auch dem Zentrifugationsverfahren drosseln den Druck auf wenige Millibar über den Umgebungsdruck.

Das Reduzieren des Druckes von z.B. 10 bar auf 5 bar, bzw. von 5 auf 1 bar vermindert bereits den vegetativen Keimgehalt im zu prüfenden Medium. Umso wichtiger ist es, die Keime bei dem Druck zu sammeln, der später bei der Gasanwendung herrscht, um möglichst alle Keime zu erfassen.

Um den gerade noch nötigen Druck zur Beladung einer mit Nährlösung gefüllten Petrischale oder eines diesbezüglich präparierten Streifens im Gasstrom zu erzeugen, muss auf sehr kleine Werte reduziert werden. Deshalb erfassen diese Methoden weniger vegetative Keime als im Medium vorher vorhanden waren.

Auch verlangen diese Methoden eine sehr hohe Sorgfalt, da Nährmedien in den Raum der Probenahme mit eingebracht werden. Falls dann durch technische oder menschliche Fehler die Nährlösung unkontrolliert austritt, kontaminiert diese bereits bei kleinsten Mengen den Raum.

- Nährmedien zur Auswertung der Keimzahl sollten nach Möglichkeit nicht in den Raum der Probeziehung eingebracht werden, insbesondere dann, wenn es sich um einen Reinraum handelt.
Kontaminationsgefahr!
- Weiter gilt: ist der Ort der Probenahme ein Reinraum, so darf kein überschüssiges Gas aus dem Probenahmegerät in den Raum austreten. Es ist darauf zu achten, dass Abgasleitungen (ggf. sterilisierbar), angebracht an der Vorrichtung, die Genauigkeit der Messung nicht wesentlich beeinflussen (der Differenzdruck an der Sammelstelle/Filter/Vorrichtung ist hierbei zu beachten).
- Bei der Membranfiltrationsmethode muss der Filterhalter einschließlich des Adapters (Kupplungsnippel) sterilisierbar sein und vor der Messung unter Berücksichtigung der bestmöglichen hygienischen Methode an die Probenahmestelle angebracht werden. Auf kürzeste Wege zwischen Messstelle und Adapter ist zu achten. Die vorangehende Autoklavierung dieser Teile mit Wasserdampf über 20 min bei 121°C ist ausreichend.
- Abschaltung und Abtrennung (Schießen der Zu- und Ableitung) des Gasstromes, falls der Vordruck während der Messung gänzlich abfällt und Störmeldung.
- Da sich im Reinraum keine Geräte befinden dürfen, die Partikel oder Keime abgeben, sollte die Einstellung der nötigen Messparameter am Gerät außerhalb des Reinraumes durchgeführt werden. Anschließend ist das Gehäuse (reinraumtauglich) zu schließen. Dann erst wird es mit der Probenahmestelle verbunden und an die Abluftleitung angeschlossen.
- Einsatz von verschiedenen inerten Gasen und Druckluft (z.B. für Luft, Sauerstoff und Stickstoff) mit nur einer Kalibration des Volumenmessgerätes (Prinzip: Massendurchfluss) unter Einhaltung der geforderten Genauigkeit.
- Akkubetrieb des Gerätes mit einem Akku von ausreichender Kapazität zur Durchführung von 15 Messungen von je 1 m³ pro Ladung.
- Kalibrierung, Funktionstest und Wartung sollte ausschließlich durch den Hersteller durchgeführt werden.
- Möglichst einfache und unkomplizierte Bedienung des Gerätes.