Verwendung des CDC-Biofilmreaktors zur Versuchsreinigung und Desinfektion von Rouging-Flächen bei rostfreiem Stahl

Einführung 

Mikroorganismen existieren in Prozessanlagen wie in der Natur nur selten als einzelne Zellen oder als Reinkultur. Sie existieren eher als Monokultur oder als Mischkultur-Gemeinschaft, die sich aus verschiedenen Mikroorganismen zusammensetzt. Mikroorganismen auf einem Biofilm, wie z. B. die Spezies der Pseudomonaden, sind gemeinhin in einer schleimigen Matrix extrazellulärer polymerer Substanzen (EPS) eingeschlossen, die für das Überleben der Mikroorganismen wichtig ist. (1) EPS spielen eine wesentliche Rolle bei der erhöhten Toleranz gegenüber Umwelteinflüssen, antimikrobiellen Mitteln und Reinigungsmitteln, einem Merkmal, das mit der Biofilmbildung zusammenhängt. Es ist von entscheidender Bedeutung, die EPS vor der Reinigung oder Desinfektion zu entfernen. 

Absolut reine Prozessgeräte wären ideal, sind aber nur selten auch Realität. Eine als Rouging bezeichnete Eisenoxid-Ablagerung tritt häufig bei der Herstellung von Behältern, an Versorgungsleitungen und vielen anderen Orten mit Biofilm-Befunden auf. Rouging wird durch Stahloxidation beim Kontakt mit wässrigen Lösungen hervorgerufen. Die Wirksamkeit von Reinigungsmitteln und Bioziden zur Entfernung des Biofilms und Desinfektion von Geräten kann bei Rouging beeinträchtigt werden, da die Oberflächenrauheit und die Substratoberflächen zunehmen. Beide Auswirkungen können zur verstärkten mikrobiellen Abweichung führen und die Biofilmentwicklung fördern.

Zweck

Rougingbehaftete Edelstahlflächen sind bei Prozessanlagen häufig vorkommende Problemstellen bezüglich Reinigung und Desinfektion. Untersucht wurde in dieser Studie der Reinigungs- und Desinfektionsaufwand bei rougingbehafteten Edelstahlblechen mit einem von P. aeruginosa ausgelösten Biofilm in einem CDC-Biofilmreaktorsystem. Reinigung und Desinfektion wurden anhand einer Oberflächenanalyse mit organisch gebundenem Gesamtkohlenstoff (TOC), Sichtprüfung auf Reinheit und mikrobieller Wirksamkeitsstudie bewertet.

Methode 

Scheibenvorbereitung für CDC-Biofilmreaktor:

CDC-Scheiben (Bleche) von 316L rostfreiem Stahl wurden mindestens 60 Minuten bei 80°C mit einem Reinigungsmittel mit einem Säuregehalt von 20% passiviert (reine Bleche). Ein Teil dieser passivierten Bleche wurde 7 Tage in eine belüftete Natriumchloridlösung gelegt, in der sich Baustahlbleche befinden (rougingbehaftete Bleche). Das vorbereitete Rouging kann innerhalb von 10 Minuten und bei 80°C mit einem Reinigungsmittel mit einem Säuregehalt von 5% bei geringer Bewegung entfernt werden.

Entwicklung des Biofilms:

P. aeruginosa ATCC® 15442TM wurde 24 Stunden lang auf R2A Agar kultiviert, in den Nährbouillon Tryptic Soy Broth (TSB)  (0,3 g/l) überführt und bei 130 Umdrehungen pro Minute (U/min) 24 Stunden bei 37°C geschüttelt, dann wieder zum TSB (0,3 g/l) in den zusammengestellten CDC-Biofilmreaktor mit den reinen und den rougingbehafteten Blechen (2, 3) überführt. Die Kultur im Biofilmreaktor wurde 24 Stunden lang bei 125 U/min und Umgebungs- oder Raumtemperatur (RT) gemischt. Nach den ersten 24 Stunden wurde die Kultur mit frischen Medien (TSB 0,3 g/l) in einer Menge von 11,7 ml/min versetzt.

Mikrobielle Wirksamkeit:

Nach der Inkubation wurden die Bleche herausgenommen, zunächst in steriles deionisiertes Wasser (DI) getaucht, dann in einer sterilen Petrischale abgelegt. Jedes Blech wurde in ein konisches 50 ml-Zentrifugenröhrchen platziert. Mit der ASTM-Einzelrohrmethode wurde ein formuliertes alkalisches Reinigungsmittel (Gehalt von 1%) bei 60°C getestet. Der entweder auf den reinen oder rougingbehafteten Blechen gebildete Biofilm wurde einer 4 ml-Reinigungsmittellösung ausgesetzt. Zur Neutralisierung der Reaktion wurden 36 ml kalter (~4°C) Letheen-Bouillon mit Asolectin und TWEEN® (LAT) zu der formulierten 4 ml-Lösung gegeben und verwirbelt. Jedes neutralisierte Blech wurde drei Verwirbelungszyklen von 30 Sekunden bei Höchstgeschwindigkeit sowie einer Ultraschallbehandlung von 30 Sekunden ausgesetzt. Entnommene Proben ergeben serielle Verdünnungen der neutralisierten Reaktionslösung. Die verdünnten Lösungen wurden auf LAT-Agar gegossen und ausplattiert, dann 2 Tage bei 37°C inkubiert. 

TOC-Test:

Die Reinigung mit einem formulierten alkalischen Reinigungsmittel (Gehalt von 1%) wurde ausgewertet. Die reinen und rougingbehafteten Bleche mit und ohne P. aeruginosa-Biofilm wurden vor der Reinigung mindestens 24 Stunden lang luftgetrocknet. (4) Die Behandlung bestand aus dem Eintauchen der Bleche in 1 l, auf 30°C vorgewärmtes und bei 300 U/min gerührtes Reinigungsmittel. Die Bleche wurden 5 Minuten lang gereinigt, mit DI-Wasser abgespült, dann mit Polyester-Swabs mit niedrigem TOC-Wert abgetupft. Die Tupfer wurden dann in 15 Minuten lang in 40 ml DI-Wasser ultraschallbehandelt und auf TOC analysiert.

Schluss 

Der CDC-Biofilmreaktor und die unterstützenden ASTM-Methoden stellen ein reproduzierbares Standardsystem zur Bewertung der problematischen Reinigung und Desinfektion bei Biofilmbildung dar. In dieser Studie wurden diese Standardmethoden mit der STERIS-Methodologie zur Simulation von rougingbehafteten Flächen kombiniert, um erstmalig ein Modell von rougingbehaftetem Edelstahl zu erstellen und dann quantitativ und qualitativ nachzuweisen, dass Rouging den Reinigungs- und Desinfektionsaufwand bei Biofilm erhöhen kann.

Die Kontamination mit Biofilm stellt eine wesentliche Herausforderung bei den regelmäßigen Reinigungs- und Desinfektionsverfahren dar. Rougingbehaftete Flächen können das Entstehen von Oberflächenverunreinigungen und die Biofilmbildung beschleunigen sowie mikrobielle Abweichungen verstärken. Dieser Synergieeffekt kann schnell hartnäckige Rouging-/Biofilm-Aggregate wie in dieser simulierten Studie hervorbringen. Der hiermit vorgeführte Reinigungstest belegt eindeutig, dass effiziente Reinigung, präventive Wartung und Desinfektionsstrategien im Rahmen einer systematischen Kontaminationsregulierung unerlässlich sind.

Literaturangaben 

(1) Hall-Stoodley, L. und Stoodley, P. (2002) Developmental Regulation of Microbial Biofilms. Current Opinion in Biotechnology. 13:228-233.

(2) ASTM E2562 – 12 Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor.

(3) Buckingham-Meyer, K., Goeres, D.M. und Hamilton, M.A. (2007) Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests. Journal of Microbiological Methods. 70: 236-244.

(4) Dell’Aringa, B., Deal, A., Klein, D., und Lopolito, P., (2013) The Use of CDC Biofilm Reactor to Test Cleaning Agents, Poster, Center for Biofilm Engineering Conference, Montana State University, 5. - 6. Febr. 2013.