Esame di idoneità di un robot pipettatore per la produzione sterile

Hamilton Microlab Star in ISO 1 Reinraum des Fraunhofer IPA

Hamilton Microlab Star in ISO 1 Camera pulita del Fraunhofer IPA. Fonte immagine: Fraunhofer IPA

Hamilton Microlab Star in ISO 1 Camera Cleanroom del Fraunhofer IPA durante una visualizzazione del flusso. Fonte immagine: Fraunhofer IPA

Hamilton Microlab Star in ISO 1 ambiente sterile del Fraunhofer IPA durante una visualizzazione del flusso. Fonte immagine: Fraunhofer IPA

Piastre di sedimentazione PCA disposte per la misurazione dei microrganismi sedimentati in un Hamilton Microlab Star. Fonte immagine: Fraunhofer IPA

Wafer di silicio disposti per la misurazione delle particelle sedimentate in un Hamilton Microlab Star. Fonte immagine: Fraunhofer IPA

Contenuto:
1           Introduzione   
2          Derivazione delle verifiche necessarie   
3          Verifiche eseguite   
3.1       Misurazione della purezza dell'aria particellare ai punti di controllo critici   
3.2       Visualizzazione del flusso   
3.3       Simulazione Media Fill   
3.4       Misurazione del rischio di contaminazione a livello di prodotto   
3.4.1    Rischio microbiologico di contaminazione   
3.4.2    Rischio particellare di contaminazione   
4        Riassunto   
5        Prospettive future   
6         Bibliografia   

1     Introduzione
Le macchine e gli impianti utilizzati nella produzione di farmaci sterili devono soddisfare requisiti rigorosi. È necessario garantire che un componente utilizzato non rappresenti mai un rischio per il prodotto durante la produzione sterile in corso. Nella produzione sterile di un'industria farmaceutica, che deve operare secondo le linee guida dell'EU-GMP Allegato 1 (1), oltre alle contaminazioni particellari, riveste un ruolo decisivo anche il carico microbiologico. Quando si riempiono fiale aperte con parenterali liquidi, si deve garantire che durante il processo di riempimento non entrino particelle o microrganismi dall'impianto nella fiala. La validazione dell'impianto per una produzione sterile include, tra le altre cose, il cosiddetto "Media Fill" secondo l'EU-GMP Allegato 1. In questa procedura, invece del prodotto, si riempie una soluzione nutritiva microbiologica in un numero specifico di fiale. Dopo l'incubazione, si determina la sterilità di ciascun contenitore.

La maggior parte dei microrganismi trasportati dall'aria sono legati a particelle tra 10 e 20 µm. In linea di principio, una riduzione delle particelle trasportate dall'aria comporta anche una riduzione corrispondente dei microrganismi trasportati dall'aria (2). Ciò sottolinea, oltre al monitoraggio microbiologico, la necessità di ulteriori misurazioni di emissione di particelle per una valutazione completa del rischio. È importante determinare le particelle trasportate dall'aria che fuoriescono dall'impianto durante il funzionamento a causa di usura e attriti tra diverse coppie di materiali. Poiché non tutte le particelle trasportate dall'aria rappresentano successivamente un reale pericolo per il prodotto, vengono inoltre misurate le particelle sedimentate a livello di prodotto. La visualizzazione del flusso aiuta a chiarire il percorso dell'aria nell'impianto e può essere utilizzata anche per la valutazione del rischio.

In questo rapporto viene mostrata una verifica di idoneità completa di un impianto per la produzione farmaceutica sterile. L'impianto testato è un robot di pipettaggio della serie Microlab Star della ditta Hamilton Bonaduz AG, Svizzera. Il sistema era stato in funzione da due anni in un normale ambiente di laboratorio al momento del test. Per ottenere un'analisi affidabile dello stato attuale del robot di pipettaggio, il sistema non è stato modificato per una successiva produzione sterile. In base ai singoli risultati, può essere eventualmente effettuata un'ottimizzazione mirata per un impiego sicuro in ambienti di produzione sterile.

2     Derivazione delle verifiche necessarie
Come base si utilizza l'attuale Allegato 1 dell'EU-GMP, che è esplicitamente richiesto per la produzione di medicinali sterili. Questo richiede misure per minimizzare il rischio di contaminazione microbiologica, particellare e da pyrogeni (vedi capitolo "Principles" della linea guida).

La classe di purezza dell'aria richiesta deve essere mantenuta anche durante il funzionamento dell'impianto. Ad esempio, quando in un processo aperto si dosano farmaci sterili, si applica la classe di protezione GMP A all'ambiente delimitato nello spazio di dosaggio, che corrisponde circa alla classe di purezza dell'aria ISO 5 secondo ISO 14644-1 (3). Nei paragrafi 4-19 della linea guida EU-GMP Allegato 1 vengono trattati dettagliatamente questi aspetti. --> Misurazione della purezza particellare dell'aria nei punti di controllo critici.

La classe di protezione GMP A di solito prevede un flusso d'aria laminare con una velocità tra 0,36 e 0,54 m/s. La linea guida EU-GMP raccomanda nel capitolo 3 un controllo e una validazione del flusso laminare durante il funzionamento. --> Visualizzazione del flusso.

La validazione di un processo asettico include sempre un cosiddetto Media Fill (vedi sezione 66 della linea guida Allegato 1 dell'EU-GMP). In questa procedura, si sostituisce la manipolazione di un prodotto farmaceutico liquido con una soluzione nutritiva. I contenitori riempiti vengono poi sigillati e incubati. Se si verifica una contaminazione microbiologica, questa cresce nel mezzo di coltura e, dopo un'adeguata incubazione, diventa chiaramente visibile. Per poter trarre conclusioni valide, in 5000 contenitori non deve esserci nemmeno un contenitore contaminato. Se anche solo uno risulta contaminato, si deve ripetere l'intera simulazione Media Fill dopo un'analisi approfondita degli errori (vedi sezione 69 della linea guida Allegato 1 dell'EU-GMP). --> Simulazione Media Fill.

Le diverse farmacopee prevedono limiti per il carico di particelle in parenterali sterili (4) (5). La probabilità di un tale carico di particelle viene determinata misurando le particelle sedimentate su wafer di silicio in corrispondenza del punto di manipolazione del prodotto aperto. --> Rischio di contaminazione particellare. Viene determinato il numero e la distribuzione delle particelle sedimentate a livello di prodotto. La stessa metodologia viene applicata alle piastre di sedimentazione PCA (Plate Count Agar) per la determinazione del --> rischio microbiologico di contaminazione.

Di seguito vengono descritte dettagliatamente le singole verifiche. Il sistema è stato inserito nel camera di misura di classe ISO 1 secondo ISO 14644-1 del Fraunhofer IPA dopo essere stato pulito. La parte superiore del robot di pipettaggio è stata rimossa, creando così una sorta di RABS (Restricted Access Barrier System), come mostrato in figura 1. L'accesso al livello di prodotto era possibile solo tramite un'apertura aperta sotto il coperchio. Il coperchio può essere aperto per manutenzione, ma rimane chiuso durante il normale funzionamento.

3     Verifiche eseguite
3.1     Misurazione della purezza particellare dell'aria nei punti di controllo critici
Per i punti di controllo critici sono stati scelti punti direttamente sotto il braccio robotico (MP01 fino a MP03). Un punto di misura (MP04) ha rilevato l'aria di scarico che fuoriesce sotto la copertura di servizio chiusa durante la misurazione. Le misurazioni e le valutazioni sono state effettuate secondo la linea guida VDI 2083 foglio 9.1 (6). Sono stati utilizzati quattro contatori di particelle LasAir II 110, Particle Measuring Systems, Inc., Boulder, Stati Uniti. Per la misurazione è stato adottato un metodo rappresentativo di riempimento, miscelazione e dosaggio di liquidi in piastre multi-well.

Tutte le misure hanno raggiunto, con una sicurezza statistica del 99,9%, la classe di purezza dell'aria ISO 4 secondo ISO 14644-1. Ciò significa che tutti i punti di misura soddisfano facilmente i requisiti dell'EU-GMP Allegato 1 riguardo alla purezza particellare dell'aria ambiente durante processi sterili aperti.

3.2     Visualizzazione del flusso
Per la visualizzazione del flusso si utilizza un generatore di nebbia di acqua ultrapura. Questo produce una nebbia fine, molto visibile, che si vaporizza senza residui dopo eventuali condensazioni sulle superfici. Attraverso diverse sequenze filmate durante un processo di pipettaggio in corso, è stato possibile dimostrare che la direzione principale del flusso, partendo dalla copertura del filtro della camera bianca, è sempre stata rispettata dal dispositivo verso il basso e lateralmente. Non sono state riscontrate zone di ristagno né flussi d'aria contrari alla direzione principale. Quando i singoli canali di pipettaggio del Microlab Star avevano una distanza sufficiente tra loro, il flusso d'aria poteva circolare liberamente tra i canali. La visualizzazione del flusso ha anche mostrato che le particelle generate dai singoli canali vengono in gran parte rimosse dal flusso d'aria e non si depositano sulla superficie del prodotto.

3.3     Simulazione Media Fill
Per la simulazione Media Fill, è stata riempita una soluzione nutritiva sterilizzata in recipienti sterili, che è stata poi distribuita in piastre multi-well sterili da 96 posizioni tramite un metodo rappresentativo di pipettaggio e mescolata con altra soluzione nutritiva. Dopo la dosatura finale nelle piastre, queste sono state sigillate con coperchi sterili, rimosse dalla camera bianca e incubate secondo le norme del mezzo nutritivo utilizzato. Dopo l'incubazione, sono state esaminate le singole cavità. Se si osserva opacità, ciò indica una contaminazione microbiologica. Esaminando tutte le 5376 cavità processate, nessuna ha mostrato opacità visibile dopo un'adeguata incubazione. Anche con un'incubazione prolungata, non è stato osservato crescita di batteri o funghi. Ciò dimostra che il robot di pipettaggio testato può, in linea di principio, superare con successo una simulazione Media Fill secondo l'EU-GMP Allegato 1, purché operi in un ambiente di camera bianca GMP A o ISO 5 o superiore. Particolarmente importante è il fatto che prima della simulazione Media Fill, il sistema non è stato sterilizzato con vapori di perossido di idrogeno o formaldeide, ma sono state solo pulite le superfici accessibili con una disinfezione con alcool isopropilico al 70%, rendendo questa simulazione un "worst case scenario". Con una sterilizzazione successiva con vapori di gas sterilizzanti, eventuali contaminazioni microbiologiche iniziali sulle superfici vengono inattivate e si manifestano solo come possibili particelle pyrogene.

3.4     Misurazione del rischio di contaminazione a livello di prodotto
Una reale contaminazione microbiologica o particellare del prodotto si verifica solo quando le particelle o i microrganismi raggiungono il contenitore, la fiala o il pozzetto tramite sedimentazione o impatto. Per simulare questa contaminazione, sono state effettuate misurazioni a livello di prodotto successivamente.

3.4.1     Rischio microbiologico di contaminazione
Per simulare il rischio microbiologico di contaminazione, sono state posizionate piastre di sedimentazione (piastre PCA, Plate Count Agar, diametro 55 mm) nelle posizioni critiche a livello di prodotto. Il processo di pipettaggio è stato ripetuto quattro volte, con una durata di esposizione di circa due ore. Un'esposizione più lunga, per aumentare la sensibilità di rilevamento, non è raccomandata a causa del rischio di essiccamento delle piastre. Dopo l'incubazione, tutte le piastre PCA sono state esaminate visivamente alla ricerca di colonie. In nessuna delle piastre sono state rilevate colonie. Il controllo positivo in ambiente di laboratorio normale ha confermato la capacità delle piastre PCA di coltivare microrganismi trasportati dall'aria. Pertanto, non è stato possibile rilevare un rischio di contaminazione microbiologica tramite microrganismi sedimentati o impattati a livello di prodotto durante quattro cicli di test. Questa verifica conferma i risultati del test Media Fill.

3.4.2     Rischio di contaminazione particellare
Per simulare il rischio di contaminazione particellare, sono stati posizionati wafer di silicio da 100 mm di diametro a livello di prodotto. Perché wafer di silicio? Per questi substrati perfettamente lisci esistono sistemi di misurazione completamente automatizzati in grado di determinare in breve tempo la concentrazione e la distribuzione delle particelle sedimentate o impattate. Al Fraunhofer IPA è stato utilizzato il sistema di misurazione Surfscan 6200 (KLA Tencor AG, Milpitas, Stati Uniti). Tutte le misurazioni sono state eseguite in ambiente di camera bianca di classe ISO 1. Dopo aver stabilito i cicli di manipolazione necessari per una misurazione affidabile, sono stati effettuati due cicli di misurazione. La contaminazione particellare delle superfici dei wafer è stata misurata prima e dopo il numero definito di cicli di manipolazione. I risultati sono stati convertiti in base all'area esposta di un singolo pozzetto della piastra multi-well da 96. Per un singolo particella tra 0,21 e 7,7 µm, la probabilità di contaminazione è risultata dello 0,05% per pozzetto. Per una particella tra 1,4 e 63 µm, la probabilità è risultata dello 0,04% per pozzetto.

Cosa significano questi valori rispetto ai limiti definiti? Per particelle > 10 µm, il capitolo 2.9.19 del Pharmacopoeia Europea definisce un limite di 6000 particelle (5). La probabilità che durante un processo di pipettaggio di 30 minuti in uno stesso pozzetto aperto entrino due particelle tra 1,4 e 63 µm è superiore a una su un milione! Pertanto, durante un processo di pipettaggio, un pozzetto non supererà statisticamente mai il limite di 6000 particelle > 10 µm, esclusi i particelle già presenti prima del processo. Naturalmente, non si considerano le particelle già presenti come contaminazione. Si assume un ambiente di camera bianca ISO 1 e un sistema di pulizia ottimale.

4     Riassunto
Tutte le verifiche eseguite hanno dimostrato l'idoneità di base del robot di pipettaggio Hamilton Microlab Star per la produzione sterile di parenterali. Non è stato riscontrato alcun rischio di contaminazione del prodotto processato.

Particelle trasportate dall'aria: Se l'ambiente di camera bianca di installazione successiva soddisfa i requisiti dell'EU-GMP Allegato 1 e ISO 14644-1, l'uso del robot di pipettaggio Hamilton Microlab Star durante il funzionamento non peggiorerà l'ambiente di camera bianca a causa di emissioni di particelle. Un ambiente GMP A, come massimo livello per la produzione sterile, viene mantenuto senza problemi anche sotto i canali di pipettaggio.

Contaminazione microbiologica: Non è stato possibile rilevare alcun rischio microbiologico né nel test Media Fill né con l'uso di piastre PCA di sedimentazione.

Particelle sedimentate: La probabilità che un pozzetto aperto o una fiala siano contaminati da particelle emesse dall'impianto è estremamente bassa. Il limite richiesto dalle farmacopee non viene mai raggiunto o superato statisticamente.

Visualizzazione del flusso: La conservazione della laminarità e della direzione del flusso d'aria primaria, come richiesto in ambienti GMP A, e la raccomandazione di separare il personale dal prodotto aperto sono rispettate dal robot di pipettaggio Hamilton Microlab Star. Ciò si ottiene grazie alle pareti che separano il flusso d'aria, all'ingresso d'aria attraverso il tetto aperto del contenitore e all'estrazione d'aria dal chassis sotto il livello del prodotto sia anteriore che posteriore. Il braccio robotico, su cui sono fissati i canali di pipettaggio, influenza la laminarità solo nelle immediate vicinanze, mantenendo comunque costante la direzione del flusso d'aria.

5     Prospettive future
Ogni ambiente di produzione presenta uno spettro individuale di particelle e microrganismi con specifici ceppi problematici, influenzati principalmente dalle condizioni ambientali e dal personale. Una verifica preliminare di idoneità non può simulare lo spettro di contaminazione che si presenterà successivamente. Ciò evidenzia la necessità che, dopo l'installazione di un impianto in una linea di produzione asettica, si esegua un Media Fill completo secondo l'EG-GMP Allegato 1, con tutti i parametri successivamente utilizzati. La verifica di idoneità descritta qui non può sostituire questa procedura, ma rappresenta solo un metodo di valutazione di base dell'idoneità di un impianto per applicazioni asettiche.

6     Bibliografia

1. EU-GMP Guide to Good Manufacturing Practice, Allegato 1. Produzione di medicinali sterili. Bruxelles: Commissione Europea, 2003.

2. USP 35 Microbiological Evaluation of Clean Rooms and other Controlled Environments. The United States Pharmacopeia. Rockville MD: United States Pharmacopeial Convention, 2012.

3. DIN EN ISO 14644-1. Camere bianche e ambienti controllati correlati - Parte 1: Classificazione della purezza dell'aria. Berlino: Beuth Verlag, 1999.

4. USP Particulate Matter in Injections. The United States Pharmacopeia. Rockville MD: United States Pharmacopeial Convention, 2011.

5. Ph. Eur. 2.9.19: Particulate Contamination: sub-visible particles. European Pharmacopeia, 7a edizione. Strasburgo: European Directorate for the Quality of Medicines and Health Care, 2010.

6. VDI 2083 Blatt 9.1. Reinraumtechnik - Reinheitstauglichkeit und Oberflächenreinheit. Berlino: Beuth Verlag, 2006.